宇测生物

始于精准致于无限

前言

神经丝轻链蛋白（NfL）是一种可以实时反映神经轴突损伤并易于检测的生物标志物，在一定程度上可能比头颅MRI（磁共振成像）更全面和便捷。

--ChristianBarro（DepartmentofNeurology,HarvardMedicalSchool,Boston,MA,USA）

NfL就是神经科的“最强CRP”--大量临床及实验研究指出在多种神经系统疾病的发生、发展过程伴随着NfL水平的改变。因此，NfL可作为神经元与轴突损伤的生物标志物，对多种神经系统疾病的诊断及用药疗效、预后评估等方面发挥着重要指导意义。

NfL到底是什么？

神经丝蛋白（Neurofilaments，NF）是构成神经元轴突中间纤维的特异性分子蛋白，同时也是神经元细胞骨架的重要成分。NF直径约为10nm，主要定位在成熟神经元的胞体和突起中，负责轴浆运输，维持神经元正常形态及保持神经纤维的弹性，防止其断裂，可促进轴突径向生长，增加轴突的直径和结构稳定性，提高轴突的脉冲传导速度。

神经丝蛋白包括神经丝三联蛋白（Neurflamenttripletproteins）、a-内切蛋白（a-internexin）、Ⅲ型外周蛋白（TypeⅢperipherin）。而神经丝三联蛋白由神经丝轻链（Neurolamentlight,NFL）、神经丝中链（Neurofilamentmiddle，NM）、神经丝重链（Neurofilamentheavy，NFH）构成。

作为神经元轴突主要的细胞骨架蛋白，神经丝蛋白发挥着维持轴突形态稳定，保证神经元信号传导的功能。当出现炎症、神经退行性变、创伤性或脑血管病等疾病引起的神经系统轴突损伤的病理过程时，神经丝蛋白被释放到细胞外空间，扩散至脑脊液（cerebrospinalfluid，CSF）中并被转运到外周血。脑脊液和血液的神经丝蛋白浓度与神经疾病变程度密切相关。

NfL被认为是神经丝三联蛋白中最重要的一部分，因为NfL是唯一可自我组装成功能性纤维的神经丝蛋白。其异常表达及相关的基因突变均会引起多种疾病的发生。另外，NfL是神经丝蛋白最丰富的亚基，也是可溶性的亚基。因此，NfL可成为体液样本中最可靠、最易检测生物标志物。

*deWaeghSM,LeeVM,BradyST.Localmodulationofneurofilamentphosphorylation.axonalcaliber,andslowaxonaltransportbymyelinat-ingSchwanncells[J].Cell,,68(3):.

NfL为什么等同于“CRP”？

影响NfL水平的因素

那么NFL是否能成为神经类的“CRP”呢？

神经系统疾病的病因和临床表现各不相同，这使得临床评估和疾病监测极具挑战性。因此，迫切需要能够量化疾病的客观监测工具，例如脑脊液/血液生物标志物。

病理条件下，NfL释放量的多少取决于轴突损伤的严重程度，并以较低浓度释放到外周血液中，NfL虽然对疾病无特异性，但可作为评估神经元轴突损伤的关键生物标志物。脑脊液/血液中NfL的浓度变化受神经元轴突损伤的影响，与神经类疾病密切相关。

轴索损伤后神经丝蛋白释放

除脑中枢神经系统以外，外周神经系统的疾病也会发生神经元损伤。临床研究发现，NfL作为神经元与轴突损伤的生物标志物，与各类疾病（包括中风、小血管病、HIV感染、头部损伤、肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病、亨廷顿病、急性脊髓损伤、视神经脊髓炎、多发性硬化症等）密切相关。同时，NfL对临床多种疾病的诊断、预后判断、生物标记、疾病严重程度的预估、检测药物的有效性等方面都有重要的指导意义。

因此，NfL极具成为神经科的“最强CRP”的潜力。

*ChristianBarro,TanujaChitnis.HowardL.Weiner.Bloodneurofilamentlight:acriticalreviewofitsapplicationtoneurologicdisease[J].AnnalsofClinicalandTranslationalNeurology,,7(12);-.

NfL在神经科的应用

目前为止，神经科针对神经类疾病的临床检查方法大部分还是利用临床评估、脑影像检查和实验室检查为主。核磁共振成像（MRI）、正电子发射断层扫描（PET）以及脑脊液检测，由于存在侵入性强，操作繁琐，价钱比较昂贵等缺点，在临床或科研使用过程中具有一定的局限性。

随着科技的发展，人们更倾向选择价格适中、非侵入性的方法来进行疾病的筛查，血液NfL的检测正好满足这些需求。尽管血液中NfL含量非常低，但取样方便，且可通过超灵敏技术检出等优势，为NfL在神经类疾病临床和科研领域的广泛应用奠定了基础。

NfL从最早期的发现，到验证脑脊液与血液之间的相关性，又进行不同人群、疾病不同时期队列的多方面验证，均证明NfL检测可作为是神经类疾病的“最强CRP”。

对神经退行性疾病中具有潜在临床效用血液生物标志物的概述

阿尔茨海默病是大脑神经退行性疾病之一，是引起老年痴呆最常见的病因。全球因阿尔茨海默病引起的痴呆患病人数占所有老年痴呆病的60-80％。阿尔茨海默病的确切发病机制尚不明确，但目前有多种假说，其中影响较广的有两类，一是β类淀粉样蛋白级联假说；二是Tau蛋白的过度磷酸化假说。

美国UniversityofCaliforniaSanDiego的KatherineJ.Bangen等人研究了患有认知衰退（阿尔茨海默病前期表征特点之一）的个体中血浆的NfL水平的变化，并对血浆中NfL是否能预测认知衰退进行了总结。

他们利用来自阿尔茨海默病神经影像学倡议（ADNI）队列，其中名参与者接受了基线抽血和为期5年的连续神经心理学测试。结果发现：相对于认知正常（CN）组，患有精细认知障碍（Obj-SCD）和轻度认知障碍（MCI）的人显示血浆NfL水平升高。在整个队列中，NfL的升高预示着认知和功能衰退的速度加快，可以判断NfL是早期阿尔茨海默病相关变性的生物标志物之一。

此外，根据年3月发表在《中华老年医学杂志》上的“中国阿尔茨海默病痴呆诊疗指南(年版)”指出：虽然血浆NfL对阿尔茨海默病不具有足够的特异性，但作为与AD神经变性相关的非侵入性生物标志物，可用于监测疾病修饰药物试验的效果监测。

AD领域的NfL的研究

多发性硬化症是免疫介导的中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，主要表现为反复发作的视力下降、复视、肢体感觉障碍、肢体运动障碍、共济失调、膀胱或直肠功能障碍等。全球约万患者，是除创伤外年轻成人永久残疾的最常见病因之一，造成较大的社会经济负担。

磁共振（MRI）是目前唯一可识别MS新病灶的技术手段，对于白质病变的成像效果较好，但对于灰质病变显示则欠佳，导致灰质病变检测被低估，影响预后判断。MS病变的边缘可以发现富含铁的活化小胶质细胞/巨噬细胞和脱髓鞘，脱髓鞘吞噬使得轴突缺失，驱动局部神经变形，神经轴索损伤释放NfL。

神经轴索损伤是决定MS病人长期功能残疾最重要的决定性因素，MRI不能准确检测出神经轴索损伤程度。有研究证实，可通过测量NfL浓度来间接反映轴索损伤程度，从而评估功能预后。

Huss等人进行了一项为期24个月的研究，针对34例复发缓解型MS（relapsingremittingMS,RRMS）病人的探索性随访观察研究。分别使用醋酸格雷替拉默和β-干扰素治疗，通过观察复发事件（expandeddisabilitystatusscale,EDSS）评分和MRI相关参数，发现病人急性期血清NfL水平高于缓解期，无复发病人的血清NfL水平从第9个月开始降低。提示除MRI外，血清NfL的纵向测量可用于监测MS活动性和治疗疗效。

因此，NfL有望成为MS早期诊断，预测疾病进展和治疗效果以及预后的潜在标记物。

帕金森病是一种常见的神经系统变性疾病，以黑质中多巴胺能神经元进行性丢失为主要病理改变，临床上多种神经系统疾病与PD症状存在相似之处。对于PD的诊断而言，关键难度在于PD及非典型帕金森疾病（APD）的对比及鉴别，即使是富有经验的运动障碍专家，若仅根据临床表现，误诊率可高达15%。

一项发表于Neurology杂志的研究对血清NfL的诊断价值进行了探讨，并对一组有明确帕金森综合征表现（即运动迟缓伴有静止性震颤或肌强直），但在采集血清和脑脊液时，其具体诊断尚不确定的病人进行长期随访（最长随访时间为12年）。最终，完成对55例PD和29例APD（22例MSA和7例PSP）及53例正常对照者的血清NfL的测定。

采用单分子免疫检测技术测定血清NfL水平，且相关操作人员不知晓受试者的临床诊断。与PD组相比，APD组血清NfL水平明显升高，以此来鉴别PD和APD有较高的准确率。

血清NfL可作为识别APD的有效临床生物标志物，即使在临床症状尚不显著的早期阶段也可适用。由此可见，血液中NfL浓度定量可以用来区分PD和APD，在基层医疗和专科诊所中可作为辅助诊断的工具。

*KateL.Lambertsen,CatarinaB.Soares,DavidGaist,Neurofilaments:TheC-ReactiveProteinofNeurology[J].BrainSci.,10,56:1-29.

*Magdalinou,N.K.;Paterson,R.W.;Schott,J.M.;Fox,N.C.;Mummery,C.;Blennow,K.;Bhatia,K.;Morris,H.R.;Giunti,P.;Warner,T.T.;etal.Apanelofninecerebrospinalfluidbiomarkersmayidentifypatientswithatypicalparkinsoniansyndromes[J].Neurol.Neurosurg.Psychiatry,86,–.

ALS早期诊断非常困难，目前尚无特效治疗，预后较差，患者平均寿命3~5年。研究和发现ALS特异性的生物标志物对于缩短诊断延迟时间、探讨和阐明发病机制、监测疾病进展和判断预后非常重要。

最具临床价值和应用前景的ALS生物标志物是脑脊液和血液中的NfL，其水平与疾病的进展速度相关，并且与上运动神经元密切相关。因此随着单分子免疫检测技术的出现，检测血液中NfL灵敏度的提高，可为ALS检测提供一种简单、无创的方法。

大量研究表明，ALS患者S-NfL或P-NfL水平较健康人群显著升高，且与CSF-NfL水平密切相关。因此不少研究者建议，在未来的研究中，可用采集血液代替脑脊液检测NfL水平，以减少腰椎穿刺给患者带来的不适感和操作风险，也便于指标变化的随访监测。

越来越来的证据表明无论是在ALS的诊断和鉴别诊断方面，还是预测疾病进展和预后方面，NfL都具有很好的应用前景。

*Onatsu,J.;Vanninen,R.;Jakala,P.;Mustonen,P.;Pulkki,K.;Korhonen,M.;Hedman,M.;Zetterberg,H.;Blennow,K.;Hoglund,K.;etal.SerumNeurofilamentLightChainConcentrationCorrelateswithInfarctVolumebutNotPrognosisinAcuteIschemicStroke.J.StrokeCerebrovasc.Dis.,28,–

亨廷顿病

（HuntingtonsDisease，HD）

亨廷顿症，又称亨廷顿舞蹈症，是一种常染色体显性的神经退行性遗传病，由HTT基因上的CAG重复扩增导致突变型亨廷顿蛋白（mutantHuntingtin,mHTT）的异常沉积而致病，目前尚无有效治疗方法。早期的症状往往是情绪或智力方面的轻微问题，紧接着在行为上是人行走的不协调和不稳定的步伐。随着疾病的进展，身体运动的不协调会变得更加明显，能力逐渐恶化直到运动变得困难，无法说话。心智能力则通常会衰退为痴呆症。亨延顿病症状通常在出现在30到50岁之间，发病时间无法控制。

HD作为一种单基因遗传病，在遗传学方面的进展已经可以帮助我们预测疾病的自然病史和进展情况，但目前有关预测疾病进展的其他方面的生物标志物很有限。既往研究显示，有关神经损伤的血液生物标志物可有助于HD的临床管理和治疗药物的研发。

伦敦大学的EdwardJ.Wild团队发表了一项为期超过2年的队列研究报告结果。与对照组相比，80名入组患者的CSF中的mHTT以及CSF、血液中的NfL在HD突变携带者中具有明显的纵向动态轨迹。这提示mHTT和NfL可作为HD的临床疾病状态、进展和脑萎缩情况的基线分析指标。另外，与mHTT相比，NfL是一个更强的HD监测和预后生物标志物。

研究表明，NfL可作为HD发病和疾病进展的一个潜在的具有预测性的血液生物标志物。随着最新一代单分子技术的发展，能够检测出血液中低丰度的HD生物标志物，并将它用于治疗和监测病程发展。

急性/短暂缺血性中风

脑卒中，俗称的中风，已经力压心脏病、肝癌、交通事故、阿尔茨海默病等疾病，成为“中国人的第一杀手”。脑卒中是一种急性脑血管疾病，由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性和出血性卒中。全球的研究者也一直致力于探究脑卒中风险的预测。

急性缺血性脑卒中（acuteischemicstrke，AIS）因神经元的丢失和反复发生的缺血事件导致严重残疾。可预测组织损伤或脑卒中复发的生物标志物能有助于指导个体化脑卒中治疗。近年来,研究发现NfL是缺血性脑卒中相关的潜在生物标志物。

一项大型前瞻性研究纳入例AIS和例短暂性脑缺血发作（transientischemicattack,TIA）病人发现，AIS病人血清NfL水平高于健康对照组。此外,该研究还发现TIA病人血液NfL水平低于AIS病人,表明NFL可以用来区分AIS和TIA病人。

随着超高灵敏的单分子免疫检测技术的发展，AIS领域的血液NfL等生物标志物的临床应用潜力逐渐被发掘。

急性中风领域的NfL的研究

*DEMARCHISGM,KATANM,BARROC,etal.Serumneurofilamentlightchaininpatientswithacutecerebrovascularevents[J].EuropeanJournalofNeurology,,25(3):-.

*KateL.Lambertsen,CatarinaB.Soares,DavidGaist,Neurofilaments:TheC-ReactiveProteinofNeurology.[J].BrainSci.,10,56:1-29.

额颞叶变性

(frontotemporallobardegeneration，FTLD)

FTLD具有隐匿起病，缓慢进展的病理特征。可能为神经元胞体特发性退行性变或轴索损伤继发胞体变化，早期出现人格和情感改变，如易激惹、暴怒、固执、淡漠和抑郁等，逐渐出现行为异常。

常规检测仍以测定脑脊液及其他辅助手段为主，但因FTLD发病隐匿，出现临床症状时已经进入不可逆转期，且目前尚无治疗方案。因此早期诊断、早期治疗显得格外重要。

美国洛杉矶大学旧金山分校的JulioC.Rojas等人，基于单分子免疫检测平台探究了与表型、基因型和疾病严重程度有关的基线血浆NfL差异，以及它是否能预测两个独立队列中的疾病进展。

研究表明，血浆NfL可以区分有症状的和无症状的突变携带者或前驱疾病。基于两个独立队列的研究，血浆NfL可确定无症状的FTLD致病突变携带者在短期内的疾病进展风险，是选择预防性临床试验被试的一个潜在工具。

*PlasmaNeurofilamentLightforPredictionofDiseaseProgressioninFamilialFrontotemporalLobarDegenerationJulioC.Rojas,PingWang,AdamM.etal.NeurologyApr,10./WNL.

其他类型神经损伤疾病

创伤性脑损伤(traumaticbraininjury,TBI)的发病机制是一个复杂的过程，影响着全球数百万人。TBI通常起源于原发性损伤，与脑部受到的外部打击直接有关，进而逐步发展为继发性损伤。继发性发病机制包括分子、化学及炎症级联反应，涉及兴奋性神经递质的释放，可导致暂时性或永久性神经功能缺损。

近日，Neurology上发表了一篇研究文章，该研究旨在明确血清NfL是否与CSFNfL、TBI诊断、损伤严重程度、脑容量和弥散张量成像（DTI）估算的创伤性轴索损伤（TAI）相关。研究人员在瑞典和美国进行了前瞻性研究（-年间）。瑞典队列包括45名曲棍球运动员，28名季赛前对照者和14名非运动员对照者。第二个队列包括名临床的参与者（名TBI和68名对照者）。

经过临床研究，在具有配对样本的运动员中，验证CSF与血清NfL相关。CSF和血清NfL可区分运动员受伤的年限及严重性。基于临床的队列研究中，入组时的NfL可区分轻度、中度和重度TBI患者。五年中血清NfL下降，但与对照组相比仍显著升高。血清NfL与功能预后，MRI脑萎缩和通过DTI对TAI的估计有关。由此可见，血清NfL有望作为急性和体育相关脑震荡以及亚急性和慢性TBI患者的生物标志物。

TBI及急性神经元损伤的血液NfL检测可能有多种临床应用：用于诊断运动所致脑震荡的神经元损伤，以及预测TBI或心脏骤停伴随缺氧性脑损伤的预后。

*PashtunShahim.etal.NeurofilamentLightasaBiomarkerinTraumaticBrainInjury[J].NeurologyMar23;96(12):.

NfL的检测方法

随着免疫分析技术的发展和进步，NfL的检测得到了令人瞩目的进展。NfL作为轴索损伤的生物标记物，准确测量其浓度可协助了解多种疾病的发展过程。在临床上脑脊液采样为创伤性检查,较外周血采样不容易获得；临床上更加希望能够用一种准确的测定方法来检测外周血中的NfL以指导临床工作。

既往的检测方法主要用酶联免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）技术测定脑脊液中的NfL浓度为主，由于血液中的NfL浓度仅为脑脊液含量的1/40，ELISA技术灵敏度不够，用于血液NfL检测时难以达到要求。对着免疫学技术的发展、研究与验证，从第一代的半定量免疫测定法，到第二代夹心ELISA法，再到第三代电化学发光（electrochemiluminescence,ECL）技术，已经大大提高了分析灵敏度。

近年来，最新一代的单分子免疫检测技术（宇测生物、Quanterix等）凭借超高分子信号识别分辨率，通过数字化的信号输出形式，实现单个分子的检测，检测灵敏度极高，通常在飞克（fg/mL）级别，超过传统免疫检测技术的0倍灵敏度，是目前最灵敏的免疫检测技术，为血液NfL在科研和临床的广泛应用提供便利。

*KHALILM,TEUNISSENCE,OTTOM,etal.Neurofilamentsasbiomarkersinneurologicaldisorders[J].NatureReviewsNeurology,,14(10):-.

总结

NfL是未来临床和科学研究中最具前景的生物标志物之一。但由于血液中低丰度的NfL水平，现有的传统方法学无法有效检出，必须要依赖于单分子超灵敏检测技术的发展。基于单分子超灵敏检测的特点，可以准确检测出血液中NfL水平变化，这也正是NfL可成为神经科“CRP”的基础条件。

NfL对于上述疾病虽然没有特异性的诊断价值，但随着血液NfL检测灵敏度不断提高，该生物标志物已经成为临床医师评估疾病轴索损伤严重程度的定量分析标志物。NfL的临床应用潜力逐渐被发掘，其作为神经系统疾病诊断、预测疾病活动性、预测疾病进展、随访预后、指导用药和疾病监测等生物标志物的证据日益增多。

当然，正如CRP在临床的应用一样，真正可以应用于临床工作之前，还需要进行一系列实验研究来评估其有效性和实用性。NfL也需要做出一个整体的综合性判断，任何单项检测数值都不能用来作为疾病的诊断依据。NfL是多种神经系统疾病的潜在生物标志物,其在正常人中的具体含量是多少，能否作为某种特定疾病的特异性标志物，诊断疾病时的具体临界值等等仍然将是未来重要的研究方向。未来需要建立统一的检测标准和流程，在不同地区和人群中进行大样本的验证性研究，进一步为NfL作为神经科“最强CRP”的临床应用提供依据。

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